metode hitungan cawan

Prosedur

A.      Penghitungan Jumlah Presumtif Coliform Dengan Metoda Hitungan Cawan

a)       Lakukan  pengenceran  contoh  secara  desimal  seperti  metoda  hitungan cawan.  Untuk  pengenceran  pertama  dianjurkan  mengambil  25  ml  contoh  yang dimasukkan ke dalam 225 ml larutan PW 0,1% steril.

b)       Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawan petri steril. Pengujian sebaiknya dilakukan secara duplo. Kemudian tuangkan 10  - 15 ml media VRBA (suhu antara 45 - 480C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur  dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakn aseperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut.

c)       Setelah memadat tuangkan kembali 3-4 ml VRBA cair  (overlay) di atas permukaan agar.

d)       Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama 18-24 jam.

e)       Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

f)        Hitung semua koloni berwarna merah keunguan yang dikelilingi zona merah (diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan  koloni  yang  lebih  banyak.  Gunakanlah  tally  counter  untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.

g)       Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh. Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi coliform.

B.      Konfirmasi Coliform

a)       Pilihlah  koloni-koloni  yang  mewakili  semua  jenis  koloni  yang  tumbuh. Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml

BGLBB  steril  dalam  tabung-tabung  reaksi  yang  telah  dilengkapi  dengan  tabung durham.

b)       Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48 jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif.

c)       Hitunglah tabung yang berisi gas. Untuk meyakinkan pertumbuhan coliform, buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.

C.      Interpretasi Hasil

Tabung positif (%) =Jumlah tabung positif                   x  100 %

10

Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya bakteri coccus atau cocoid, Gram

negatif. Uji konfirmasi E.  coli  dilanjutkan  ke  uji  biokimia  IMViC  (Indol-Voges

Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut:

a)      Produksi Indole.

Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 24

jam. Tambahkan 0,2  - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan

indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.

b)      Voges-Proskauer.

Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48

jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan

0,6 larutan  alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu

tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji

positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin.

c)      Methyl red.

Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu 350C selama 48 jam.

Tambahkan  5  tetes  larutan  methyl  red  ke  masing-masing  tabung.  Positif  test

ditunjukkan  dengan  adanya  warna  merah  yang  jelas.  Sedangkan  reaksi  negatif

ditunjukkan dengan adanya warna kuning.

d)     Citrate.

Inokulasi  secara  ringan  tabung  yang  berisi  Koser  citrate  broth; hindari adanya

kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu 350C selama

9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif.

e)      Pembentukan gas dari fermentasi laktosa.

Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam.

Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau

timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.

f)       Interpretasi.

Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu

350C  dalam  48  jam,  2)  muncul  sebagai  bakteri  coccus,  Gram  negatif,  dan  3)

mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan

sebagai  E.  coli.  Hitung  MPN  E.  coli  berdasarkan  tabung-tabung  EC  yang

mengandung E. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.

Penghitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan cawan

Metoda ini digunakan untuk menghitung jumlah S. aureus lebih besar dari 100 sel S.

aureus  per  ml/gram  contoh.  Metoda  yang  biasa  digunakan  adalah  metoda

sebar/permukaan.

1.       Prinsip

Manitol akan diubah oleh Staphylococcus yang tumbuh menjadi asam dan susuana

asam ini akan mengubah indikator phenol red menjadi kuning. Tellurite yang ada

akan menjadi tellurite yang berwarna hitam.

2.       Media, pereaksi

a)       Baird Parker Agar (BPA) (tambahkan 5 ml  egg yolk tellurite ke dalam 95 ml agar cair

b)       Trypticase Soy Agar (TSA)

c)       Brain Heart Infusion (BHI) broth

d)       Coagulase plasma kelinci mengandung EDTA 0,1%

e)       Buffered Peptone Water (BPW) 0,1%

3.       Prosedur

3.1  Isolasi dan enumerasi S. aureus

a)      Buat pengenceran desimal terhadap contoh seperti metoda hitungan cawan.

b)      Pindahkan 0,1 ml suspensi contoh dari masing-masing pengenceran ke dalam cawan petri berisi BPA.

c)      Dengan spreader sebarkan suspensi contoh di atas permukan agar secara merata  dan  biarkan  suspensi  contoh  terserap  ke  dalam  media  agar  dengan mendiamkan cawan-cawan tersebut sekitar 10 menit.

3.2  Inkubasi

a)       Inkubasikan  cawan-cawan tersebut dengan posisi tutup berada di bawah pada suhu 35-370C selama 45-48 jam.

b)        Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.

3.3 Penghitungan jumlah presumtif S. aureus

3.3.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni tipikal S. aureus yang jumlahnya

antara 20  -  200  koloni.  Bila  cawan  dari  tingkat  pengenceran berbeda memiliki

jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang

lebih banyak. Koloni khas S. aureus adalah bulat, licin halus, cembung, basah dan

berdiameter 2-3 mm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat,

dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang jelas.

3.3.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung tipikal koloni, dan berilah tanda

koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. Bila ditemukan

adanya beberapa jenis koloni, hitung dan catat jenis koloni. Uji konfirmasi dapat

dilakukan dengan uji koagulase, clumping faktor dan pewarnaan Gram.

3.4. Uji konfirmasi S. aureus dengan uji koagulase

3.4.1 Pindahkan koloni yang diduga S. aureus ke dalam tabung berisi 0,2-0,3 ml

BHI broth dan larutkan dengan seksama.

3.4.2 Tambahkan 0,5 ml  coagulase plasma yang mengandung 0,1 5 EDTA ke

dalam kultur BHI dan campur dengan seksama. Kemudian inkubasikan pada suhu

350C dan periksa secara periodik adanya penggumpalan setiap 6 jam sekali. Reaksi

positif S. aureus ditunjukkan bila terjadi gumpalan yang kokoh dan lengkap dan

apabila tabung dijentikkan atau dibalik, gumpalan tadi akan tetap berada ditempat

semula. Penggumpalan parsial, dinyatakan dengan reaksi koagulase 2+ dan 3+,

harus dilanjutkan dengan uji lebih lanjut.

3.4.3 Bila reaksi koagulase dari kultur yang diduga tidak dapat dipastikan berasal

dari S. aureus, maka inokulasikan kultur tersebut pada kultur yang sudah diketahui

positif dilanjutkan pada kultur yang sudah diketahui negatif S. aureus.

3.4.4 Lakukan pewarnaan Gram terhadap semua kultur yang diduga  S. aureus

dan periksa di bawah mikroskop.

4.       Interpretasi Hasil/Perhitungan

Jumlah S. aureus per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni

dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran